Ciljanje gena
Ciljanje gena je genetička tehnika koja se koristi homolognu rekombinaciju za promenu endogenog gena. Ovaj metod se može koristiti za brisanje gena, uklanjanje eksona, dodavanje gena, i uvođenje mesta mutacija. Ciljanje gene može da pute trajno ili uslovno. Uslovi mogu da budu specifično vreme tokom razvoja / života organizma ili ograničenje na specifična tkiva. Ciljanje gena zahteva kreiranje specifičnih vektora za svaki željeni gen. Metod se može koristiti za svaki gen, nezavisno od transkripcione aktivnosti ili veličine gena.
Metodi ciljanja gena su razvijeni za nekoliko model organizama i mogu da variraju u zavisnosti od korišćene vrste. Generalno se ciljna konstrukcija formira od DNK generisane u bakterijama. Ona tipično sadrži deo ciljnog gena, reporter gen, i (dominantni) selektivni marker.
Da bi se menjali geni miša, ova konstrukcija se zatim umetne u embrionske matične ćelije u kulturi. Nakon selekcije ćelija sa korektnim umetanjem, one se mogu koristiti unutar tkiva miša putem embrionske injekcije. Konačno, himerni miševi gde su modifikovane ćelije formirale reproduktivne organe se biraju procesom uzgoja. Nakon tog koraka celokupno telo miša je bazirano na izabranim embrionskim matičnim ćelijama.
Kod mahovine, ova konstrukcija se inkubira zajedno sa sveže izolovanim protoplastima i polietilen glikolom. Mahovine su haploidni organizmi,[2] te se regeneracija filamentata mahovine (protonema) može direktno testirati za prisustvo genskih promena, bilo tretmanom antibioticima ili primenom PCR-a. Pošto su mahovine jedinstvene među biljkama, ova procedura za reverznu genetiku je jednako efikasna kao i kod kvasaca.[3] Upotrebom prilagođenih procedura, ciljanje gene je uspešno primenjeno i kod goveda, ovci, svinja, i mnogih gljiva.
Frekvencija ciljanja gena se može znatno poboljšati upotrebom dizajniranih endonukleaza kao što su nukleaza cinkovog prsta,[4] dizajniranih homing endonukleaza,[5] i nukleaza baziranih na dizajniranim TAL efektorima.[6] Ovaj metod je primenjen na brojne vrste među kojima su Drosophila melanogaster,[4] duvan,[7][8] kukuruz,[9] ljudske ćelije,[10] miševi,[11] i pacovi.[11]
- ↑ Egener, T.; Granado, J.; Guitton, M. C.; Hohe, A.; Holtorf, H.; Lucht, J. M.; Rensing, S. A.; Schlink, K. et al. (2002). „High frequency of phenotypic deviations in Physcomitrella patens plants transformed with a gene-disruption library.”. BMC Plant Biology 2: 6. DOI:10.1186/1471-2229-2-6. PMC 117800. PMID 12123528.
- ↑ Ralf Reski (1998): Development, genetics and molecular biology of mosses. Botanica Acta 111, 1-15.
- ↑ Ralf Reski (1998): Physcomitrella and Arabidopsis: the David and Goliath of reverse genetics. Trends Plant in Science 3, 209-210. [1] Arhivirano 2012-09-10 na Archive.is-u
- ↑ 4,0 4,1 Bibikova, M.; Beumer, K.; Trautman, J.; Carroll, D. (2003). „Enhancing Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases”. Science 300 (5620): 764. DOI:10.1126/science.1079512. PMID 12730594.
- ↑ Grizot, S.; Smith, J.; Daboussi, F.; Prieto, J.; Redondo, P.; Merino, N.; Villate, M.; Thomas, S. et al. (2009). „Efficient targeting of a SCID gene by an engineered single-chain homing endonuclease”. Nucleic Acids Research 37 (16): 5405. DOI:10.1093/nar/gkp548. PMC 2760784. PMID 19584299.
- ↑ Miller, J. C.; Tan, S.; Qiao, G.; Barlow, K. A.; Wang, J.; Xia, D. F.; Meng, X.; Paschon, D. E. et al. (2010). „A TALE nuclease architecture for efficient genome editing”. Nature Biotechnology 29 (2): 143. DOI:10.1038/nbt.1755. PMID 21179091.
- ↑ Cai, C. Q.; Doyon, Y.; Ainley, W. M.; Miller, J. C.; Dekelver, R. C.; Moehle, E. A.; Rock, J. M.; Lee, Y. L. et al. (2008). „Targeted transgene integration in plant cells using designed zinc finger nucleases”. Plant Molecular Biology 69 (6): 699–709. DOI:10.1007/s11103-008-9449-7. PMID 19112554.
- ↑ Townsend, J. A.; Wright, D. A.; Winfrey, R. J.; Fu, F.; Maeder, M. L.; Joung, J. K.; Voytas, D. F. (2009). „High-frequency modification of plant genes using engineered zinc-finger nucleases”. Nature 459 (7245): 442–445. Bibcode 2009Natur.459..442T. DOI:10.1038/nature07845. PMC 2743854. PMID 19404258.
- ↑ Shukla, V. K.; Doyon, Y.; Miller, J. C.; Dekelver, R. C.; Moehle, E. A.; Worden, S. E.; Mitchell, J. C.; Arnold, N. L. et al. (2009). „Precise genome modification in the crop species Zea mays using zinc-finger nucleases”. Nature 459 (7245): 437–41. Bibcode 2009Natur.459..437S. DOI:10.1038/nature07992. PMID 19404259.
- ↑ Urnov, F. D.; Miller, J. C.; Lee, Y. L.; Beausejour, C. M.; Rock, J. M.; Augustus, S.; Jamieson, A. C.; Porteus, M. H. et al. (2005). „Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases”. Nature 435 (7042): 646–651. Bibcode 2005Natur.435..646U. DOI:10.1038/nature03556. PMID 15806097.
- ↑ 11,0 11,1 Cui, X.; Ji, D.; Fisher, D. A.; Wu, Y.; Briner, D. M.; Weinstein, E. J. (2010). „Targeted integration in rat and mouse embryos with zinc-finger nucleases”. Nature Biotechnology 29 (1): 64. DOI:10.1038/nbt.1731. PMID 21151125.