Elektroforeza
Elektroforeza je metod koji se između ostalog koristi u molekularnoj biologiji kako bi se razdvojili fragmenti DNK molekula i utvrdili njihove veličine prema veličinama fragmenata koje su unapred poznate.
Elektroforeza, kako samo ime nagovešta, radi na principu električnog polja u kojem se DNK molekul kreće kroz smešu i kraći DNK fragmenti se kreću mnogo brže od dužih fragmenata, jer je kraćim fragmentima lakše da se kreću kroz smešu. Proteini se takođe mogu razdvojiti na ovaj način na osnovu njihovog naelektrisanja i veličine. Smeše koje se koriste za pravljenje mogu biti od različitog materijala, ali do sada se najbolje pokazala smeša, tj gel napravljen od agaroze. Brzina kretanja fragmenata kroz gel zavisi od više faktora. Koncentracija agaroze je jedan od faktora. Što je koncentracija viša, kretanje fragmenata, pogotovo velikih fragmenata, je teža. Sam oblik DNK fragmenata koji se kreće takođe ima uticaj na brzinu. Na primer DNK molekul može biti linearni, spiralno uvijen u krug ili linearni sa manjim oštećenjima. Svaki od ovih oblika ima drugačiju brzinu kretanja, spiralno uvijeni je najbrži, dok je linearni najsporiji. Prisustvo Etidijum Broma (EtBr) može da uspori kretanje DNK molekula jer EtBr ima tu osobinu da može da razreši DNK molekul pri samom kretanju. Takođe i napon (elektročno polje) koji se koristi ima uticaj na kretanje, na primer najmanje moguće polje je oko 5-8 V/cm.
Materijal potreban za elektroforezu:
- DNK fragmenti koji će se analizirati
- Supstanca zvana DNK merdevine koja se sastoji od smeša DNK fragmenata poznatih veličina. DNK fragmente koji nas interesuju kada se razdvoje možemo da uporedimo sa merdevinama, jer znamo već unapred njihovu veličinu.
- Pufer koji se obično koristi je TBE 0,5x, pH 8,0
- Agaroza
- Etidijum bromid (5,25 mg/ml u H2O)
- Marker koji sadrži boju, kao što je bromofenol plava, koja omogućava da pratimo kretanje DNK fragmenata
- Plastična posuda za elektroforezu
- Češalj koji pre nego što se agaroza stvrdne stavimo u smešu i kad se agaroza stvrdne, češalj izvadimo, i ostanu nam džepovi u koje stavljamo DNK fragmente koje želimo da analiziramo.
- Napraviti 0,8 % smešu od agaroze u 0,5x TBE. Ovo se može pripremiti tako što se izmeri 24g agaroze i tome se doda 30 ml 0,5x TBE rastvora.
- Ovu tečnu smešu grejati u mikrotalasnoj pećnici dok ne proključa i dok tečnost ne postane potpuno bistra.
- Kad je tečnost potpuno bistra ostaviti da se malo rashladi do 60°C na sobnoj temperaturi. Pri tom mešati rastvor dok se hladi.
- Dodati 1 μl Etidijum Broma na svakih 10 ml rastvora. Etidijum Bromid je mutagen i zato je neophodno nošenje nitrilskih rukavica.
- Kad je rastvor dovoljno rashlađen, da ne bude previše vruć, tečnost sipati u plastičnu posudu za elektroforezu.
- Staviti češalj na oko 5-10 mm od vrha smeše.
- Kada se smeša dovoljno rashladi, otprilike posle 30 do 40 minuta, agaroza se stvrdne i smeša postane gel, tj želatinasta smeša, koja je dovoljno fleksibilna a i dovoljno stvrdnuta da se sam gel ne raspadne. Izvaditi češalj.
- U prvi džep, koji je napravljen zahvaljujući češlju se uvek stavlja DNK merdevina, a u ostale DNK fragmenti koje želimo da analiziramo.
DNK molekuli se kreću u eletričnom polju nastalom dovodom napona. Kako je DNK molekul, pa samim tim i fragmenti, negativno naelektrisan, on se kreće od negativno naelektrisane katode ka pozitivno naelektrisanoj anodi. I pri tom kretanju se fragmenti prema svojoj veličini razdvajaju.
Kao krajnji produkt imamo gel sa razdvojenim fragmentima, kao što je na slici levo. U prvoj i poslednjoj koloni možemo da vidimo merdevine koje sadrže različite veličine i pomoću kojih možemo da uporedimo fragmente u sredini. Boja bromofenol plava je uspela da se nadoveže na DNK fragmente i pomoću ovo boje je uopšte i moguće sada videti fragmente i koliko daleko su se kretali od džepova.
- IMPROVED ELECTROPHORETIC DNA SEQUENCING TECHNOLOGY
NIH Guide, Tom 24, Broj 9, mart 10, 1995.